Aktivierung

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 604 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die CAR-T-Zelltherapie ist ein schnell wachsender Bereich onkologischer Behandlungen, der das Potenzial hat, zur Standardbehandlung für mehrere Indikationen zu werden. Zufälligerweise hält die CRISPR/Cas-Genbearbeitungstechnologie Einzug in die Herstellung von CAR-T-Zellprodukten der nächsten Generation und verspricht eine präzisere und kontrollierbarere Zellmodifikationsmethode. Die Schnittstelle zwischen diesen medizinischen und molekularen Fortschritten bietet die Möglichkeit für völlig neue Wege zur Entwicklung manipulierter Zellen, um die derzeitigen Einschränkungen der Zelltherapie zu überwinden. In diesem Manuskript präsentieren wir Proof-of-Concept-Daten für eine technische Rückkopplungsschleife. Mithilfe der CRISPR-vermittelten gezielten Integration haben wir aktivierungsinduzierbare CAR-T-Zellen hergestellt. Dieser neue Typ manipulierter T-Zellen exprimiert das CAR-Gen abhängig von ihrem Aktivierungsstatus. Dieser Kunstgriff eröffnet neue Möglichkeiten zur Regulierung der CAR-T-Zellfunktion sowohl in vitro als auch in vivo. Wir glauben, dass ein solches physiologisches Kontrollsystem eine leistungsstarke Ergänzung zum derzeit verfügbaren Werkzeugkasten von CAR-Konstrukten der nächsten Generation sein kann.

Gentechnisch veränderte T-Zellen, die den modifizierten T-Zell-Rezeptor (TCR) oder den chimären Antigen-Rezeptor (CAR) exprimieren, sind wirksame Instrumente zur Behandlung bösartiger Tumorerkrankungen1. Bis heute wurden mehrere CAR-T-Zelltherapien gegen hämatologische Erkrankungen zugelassen, und eine Vielzahl weiterer wird in klinischen Studien evaluiert2. Alle aktuellen kommerziellen Produkte nutzen die Genübertragung auf der Basis viraler Vektoren3. Obwohl dies eine gut etablierte und relativ sichere Strategie ist, weist sie einige erhebliche Einschränkungen auf. Mechanistisch gesehen beruhen moderne virale Vektoren auf einer unkontrollierten, halbzufälligen Integration. Obwohl die Sicherheit viraler Vektoren durch die zunehmende Zahl von Patienten, die mit CAR-T-Zellprodukten behandelt werden, nachgewiesen ist und die Sicherheit der viralen Genübertragung von Gesundheitsbehörden anerkannt wurde, bleibt das inhärente Risiko einer Insertionsmutagenese ein ungelöstes Problem4,5,6. Daher zielt die Herstellung von T-Zellen der nächsten Generation darauf ab, besser kontrollierte Methoden zur Genbearbeitung wie CRISPR/Cas einzusetzen. CRISPR/Cas ermöglicht eine präzise gezielte Genintegration an vordefinierten Orten im Genom7. Dies wiederum macht den Bearbeitungsvorgang nicht nur präziser, sondern eröffnet auch die Möglichkeit, die Genintegrationsstelle zu nutzen.

Bisher werden alle klinisch verwendeten CAR-Genkassetten von starken, konstitutiv aktiven künstlichen Promotoren gesteuert, die die dynamische Transkriptionsregulation überschreiben, die in einem physiologischen Umfeld auftritt und direkte Auswirkungen auf die Aktivierungskinetik, den Phänotyp und das Überleben hat8. Eine kontinuierliche CAR-Expression kann in vivo zu Erschöpfung und suboptimaler CAR-Funktionalität führen9. Die CRISPR/Cas-Technologie ermöglicht den Gentransfer stromabwärts von jedem endogenen Promotor, wodurch der Bedarf an manipulierten oder externen Promotoren reduziert wird und der Schwerpunkt auf physiologischeren Zellmodifikationen liegt8,10. Native Promotorregionen ermöglichen eine stark regulierte Gentranskription. Die komplexen Sequenzmuster leiten regulatorische Hinweise von distalen Enhancern und den damit verbundenen modulierenden Proteinen weiter und führen zu einer eindeutigen Transkription11. Die Erhaltung der hochentwickelten physiologischen Genregulation kann dabei helfen, differenzierte Zellprodukte zu entwickeln. Es wurde gezeigt, dass ein besseres Targeting von CARs und manipulierten TCRs klare Vorteile für die Wirksamkeit und Funktion von editierten T-Zellen bringt, indem künstliche Gene unter der Kontrolle endogener TCR-Promotoren eingefügt werden und so eine physiologischere (Trans-)Genexpression bereitgestellt wird12.

Darüber hinaus kann eine gut durchdachte Bearbeitungsstrategie die Präzision der CAR-vermittelten Tötung verbessern. CAR-T-Zellen sind sehr wirksam bei der Lyse von Zellen, die das Zielantigen exprimieren (z. B. CD7, CD19 oder BCMA), sie unterscheiden jedoch nicht zwischen gesunden und abnormalen Zellen13,14,15. Daher greifen CAR-T-Zellen nach Erfüllung ihrer anfänglichen Aufgabe der Tumorbeseitigung weiterhin alle Zellen an, die ihr zugehöriges Antigen exprimieren16. Es wurden mehrere Ansätze vorgeschlagen, um diese On-Target-Nebenwirkungen persistierender CAR-T-Zellen außerhalb des Tumors zu umgehen. Beispielsweise können CAR-T-Zellen nach vollständiger Tumorbeseitigung durch systemische Verabreichung von Antikörpern, die gegen einen synthetischen „Kill-Switch“ gerichtet sind, der auf CAR-T-Zellen koexprimiert wird, ausgerottet werden, was zu einer vollständigen und anhaltenden Erholung der B-Zellen führt17. Eine weitere Option ist die mRNA-basierte transiente Expression von CAR, die T-Zellen nur so lange gegen Zielzellen lenkt, wie mRNA systemisch zugeführt wird18,19. Bei solchen Ansätzen bestehen jedoch Herausforderungen hinsichtlich der Verteilungskinetik, Präzision, Penetration und Persistenz der angewendeten Moleküle.

Eine weitere Methode zur Reduzierung von Schäden an gesundem Gewebe sind logisch gesteuerte CAR-T-Zellen20. Beispielsweise können „AND“-verknüpfte CAR-T-Zellen Tumorzellen präziser von gesundem Gewebe unterscheiden, da sie nur durch die doppelte Antigenerkennung auf Zielzellen eine Effektorfunktion ausüben21. Die Zerstörung von gesundem Gewebe wird jedoch nur dann sicher verhindert, wenn beide Antigene räumlich genug voneinander getrennt sind, um eine Doppelerkennung zu verhindern. Darüber hinaus wurden in präklinischen Modellen auch „NOT“- und „OR“-gesteuerte CARs beschrieben22. Diese Logikgatter scheinen ein sehr ansprechender und ausgefeilter Ansatz zur Regulierung der Funktion editierter T-Zellen zu sein, erfordern jedoch eine komplexe Zelltechnik und die genetische Nutzlast ist umfangreich23.

Kürzlich wurde eine elegantere Methode beschrieben, bei der der CRISPR-vermittelte Knock-in von IL-15 in den induzierbaren Locus von IL-1324 gelenkt wurde. Die Autoren beobachteten einen signifikanten, wenn auch moderaten Anstieg der IL-15-Produktion bei Zellstimulation, was ihr Konzept bestätigte, aber auch die Bedeutung einer angemessenen Locus-Auswahl hervorhob.

In diesem Artikel schlagen wir eine Erweiterung des gezielten Ansatzes vor, um das Problem der anhaltenden Zerstörung von Gewebe außerhalb des Tumors auf dem Zielgebiet nach der Tumorentfernung durch Kontrolle der TCR/CAR-Genexpression zu lösen. Unsere Strategie zielt darauf ab, die notwendige genetische Ladung zu reduzieren und verlässt sich stattdessen auf die physiologische Regulierung des manipulierten Proteins. Zu diesem Zweck schlagen wir die Verwendung von Konstrukten vor, die an Orten von Molekülen eingebettet sind, die über physiologische Signalkaskaden vorübergehend und stark exprimiert werden. Im Fall von T-Zellen liegen die scheinbaren Zielorte stromabwärts von Promotoren, die ihre zugehörigen Proteine bei T-Zell-Aktivierung hochregulieren (z. B. Nur77, FoxP3, CD69, PD-1, HLA-DR)25,26. Mit diesem Ansatz haben wir ein zeitlich reguliertes System geschaffen, bei dem das Fortbestehen der T-Zell-Stimulation (exogen oder endogen) Voraussetzung für die Ausübung der CAR/TCR-Funktion ist. Wir nennen es eine künstliche Rückkopplungsschleife: Wenn Zellen aktiv sind, wird das Zielkonstrukt ausgedrückt. In dieser Studie haben wir die Machbarkeit durch In-vitro- und In-vivo-Proof-of-Concept-Experimente demonstriert. Wir sind davon überzeugt, dass unsere technische Rückkopplungsschleife in fortschrittlichen Zelltherapieanwendungen genutzt werden kann.

Wir gingen davon aus, dass theoretisch jedes Konstrukt auf ähnliche Weise wie eine endogene Hoch- oder Herunterregulierung reguliert werden kann, wenn es an einem geeigneten Ort gezielt und über homologe Rekombination eingefügt wird. Als Proof-of-Concept-Beispiel haben wir Anti-CD19-CAR-T-Zellen als verfügbare und relevante Umgebung für das therapeutische T-Zell-Engineering ausgewählt (Abb. 1a). In diesem Fall wird das CAR-Konstrukt in den Bereich stromabwärts eines T-Zell-aktivierungsabhängigen Promotors integriert und zerstört gleichzeitig die kodierende Sequenz des endogen kodierten Proteins. Bemerkenswert ist, dass der TCR/CD3-Komplex für beabsichtigte Auswertungen unbearbeitet blieb, was eine klassische (Re-)Stimulation von Anti-CD3/CD28-T-Zellen ermöglicht, die unabhängig von der Anti-CD19-Antigen-spezifischen Aktivierung ist. In unserem Beispiel werden T-Zellen zunächst polyklonal stimuliert und dann mit dem CRISPR/Cas9-System modifiziert, wobei das CAR-Gen in den spezifischen Genlocus integriert wird und die Downstream-Sequenz durch das CAR ersetzt (Abb. 1a). Unsere Bearbeitungsstrategie folgt herkömmlichen CRIPSR-Protokollen, bei denen die Bearbeitung 24 bis 48 Stunden nach der Aktivierung erfolgt, und steht im Einklang mit modernsten CAR-T-Zell-Herstellungsprozessen (z. B. ultrakurzen Prozessen), die eine anfängliche polyklonale Stimulation erfordern. Solange diese anfängliche Zellaktivierung aufrechterhalten wird (insbesondere in einer antigenspezifischen Umgebung), wird das CAR weiterhin exprimiert, wodurch eine positive Rückkopplungsschleife entsteht (die Aktivierung über die CAR-Zielerkennung erleichtert die weitere CAR-Proteinproduktion) (Abb. 1a). Diese konstruierte Rückkopplungsschleife sollte die Steuerung der CAR-Expression durch den Zellaktivierungszustand ermöglichen.

a Schematische Darstellung der CAR-Expression unter der Kontrolle eines aktivierungsabhängigen Promotors. b Physiologische Expressionskinetik der Aktivierungsmarker PD1, CD25, CD69, TIGIT und TIM3. Die Grafik zeigt die Markerexpression im Zeitverlauf von mindestens drei Spendern. Die Zellen wurden nach der anfänglichen Stimulation nach d1 auf d6 (Pfeil) restimuliert. Verbindungslinien stellen den Mittelwert dar. c CAR kann erfolgreich in den PD1-Locus eingeschleust werden. Es werden repräsentative Punktdiagramme und Histogramme angezeigt. Parzellen, die vorab mit lebenden, einzelnen CD45+-Zellen bepflanzt sind. d Die CAR-Expression unter dem PD1-Locus ist aktivierungsabhängig von der polyklonalen Anti-CD3/CD28-Stimulation. Die Diagramme zeigen den CAR-Ausdruck als willkürliche Einheiten (AU) in ruhenden oder restimulierten Proben aus drei unabhängigen Experimenten. Als Kontrolle wurden CAR-Konstrukte verwendet, die auf den TRAC-Locus abzielten und über eine lentivirale (LV) Zufallsintegration exprimiert wurden. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD dar. Die Signifikanz wurde mithilfe des ungepaarten Student-T-Tests analysiert. Die CAR-T-Zellen können durch antigenspezifische Stimulation vermehrt werden. Die Grafik zeigt die Faltungsexpansion nach zwei Runden antigenspezifischer Stimulation. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD dar. f Antigenspezifische Expansion führt zu einem erhöhten CAR-T-Zellgehalt in allen Proben, wohingegen die polyklonale Restimulation den CAR-T-Zellgehalt nur bei aktivierungsinduzierter CAR-Expression erhöht. Die Diagramme zeigen die angegebene Markerexpression als Häufigkeit in ruhenden oder restimulierten Proben aus drei unabhängigen Experimenten. Dargestellt sind CAR-Konstrukte, die auf den PD1-Locus abzielen und über die lentivirale (LV) Zufallsintegration exprimiert werden. Pfeile zeigen den Beginn (d0) und das Ende (d2) der Stimulationsperiode an. Verbindungslinien stellen den Mittelwert dar. Die Signifikanz wurde mithilfe des gepaarten Student-T-Tests analysiert.

Um unsere Hypothese zu testen, haben wir mehrere bekannte Marker ausgewertet, die bei T-Zell-Stimulation hochreguliert werden (Abb. 1b). Als Auswahlkriterien beurteilten wir die Expressionskinetik, das Restimulationspotential sowie die biologische Signifikanz. Wir konzentrierten uns zunächst auf zwei klassische T-Zell-Aktivierungsmarker – CD25 und CD69 –, testeten aber auch die Hochregulierung von PD-1-, TIGIT- und TIM3-Markern. Diese letztgenannten Rezeptoren werden bei T-Zell-Stimulation nicht nur hochreguliert, sondern ihr längeres Vorhandensein korreliert auch mit der Erschöpfung der T-Zellen26. Für die erste Bewertung erwies sich CD25 als ungeeignet für unseren Ansatz, da seine Expression sogar während der gesamten Ruhephase erhöht war (Abb. 1b). Wahrscheinlich wurden TIGIT und TIM3 ausgeschlossen, da ihre Expression nach der Stimulation unter 50 % lag (Abb. 1b). Letztendlich haben wir PD-1 ausgewählt, da seine Funktion am besten charakterisiert ist und die PD-1-Hemmung eine weit verbreitete Technik bei Check-Point-Inhibitor-Behandlungen ist27. Theoretisch kann die Störung von PD-1 Vorteile für CAR-T-Zellen mit sich bringen, wie bereits beschrieben28,29. Daher konzentrierten wir uns bei den ersten Experimenten auf das CAR-Targeting in den PD-1-Locus, um ein 2-in-1-Modell zu etablieren, in dem wir die CAR-Expression einer technischen Rückkopplungsschleife mit dem potenziellen Nutzen des PD-1-Knockouts (KO) kombinieren. . Um eine breitere Anwendung unseres Konzepts zu demonstrieren, haben wir außerdem das Targeting des CD69-Locus getestet (ergänzende Abbildung 1a-b). In unserem Modell verwendeten wir menschliche primäre T-Zellen, die mit löslichem Anti-CD3/CD28-Reagenz (Expamers) stimuliert wurden, und verwendeten ein nicht-virales CRISPR/Cas9-Abgabesystem und eine dsDNA-HDR-Vorlage, wie zuvor beschrieben8. Editierte T-Zellen exprimierten das CAR-Konstrukt problemlos, wiesen jedoch fast keine Restexpression von PD-1 auf, was auf eine erfolgreiche gezielte Integration sowie einen sehr effizienten PD-1-KO hinweist (Abb. 1c, ergänzende Abb. 2). Diese Zellen wurden dann entweder nicht stimuliert, um die Ruhephase zu erreichen, oder mit einer zusätzlichen Dosis Expamers erneut stimuliert. 24 Stunden nach der Restimulation wurde die CAR-Expression bewertet (Abb. 1d). Im Gegensatz zu den Kontrollen (CAR-Gen-Knock-in (KI) in den TRAC-Locus und zufällig durch LV-Transduktion integriertes CAR-Konstrukt) stieg die Expression des CAR-Konstrukts, das sich stromabwärts des PD-1-Promotors befindet, nach der Restimulation signifikant an (Abb. 1d). Dies war die erste experimentelle Validierung, dass durch unseren Ansatz eine konstruierte Rückkopplungsschleifen-CAR-Expression erreicht werden kann. Interessanterweise scheint die CAR-Expression in CRISPR/Cas-editierten Zellen in vitro im Laufe der Zeit (und unabhängig vom Aktivierungszustand) spontan zuzunehmen, im Gegensatz zu LV-vermittelten, zufällig integrierten Rezeptoren (Abb. 1d), was wiederum auf die unvollständige PD-1-Herunterregulierung im Ruhezustand hinweist Phase in dieser In-vitro-Umgebung (Abb. 1b) und könnte auf eine verbesserte Fitness von CAR-manipulierten T-Zellen hinweisen.

Als nächstes beschlossen wir, die Robustheit unseres induzierbaren CAR-Konzepts über einen längeren Zeitraum von zwei Runden antigenspezifischer Stimulation zu testen (Abb. 1e). Wir gehen davon aus, dass die antigenspezifische Stimulation die relative Häufigkeit der Anti-CD19-CAR-T-Zellpopulation in den Proben unabhängig von der Art der verwendeten Bearbeitung erhöhen wird. Zu diesem Zweck haben wir CAR-T-Zellen mithilfe der von B-Zellen abgeleiteten Lymphoblastoid-Zelllinie (LCL) expandiert, die das CD19-Zielantigen exprimiert. Nach einer Woche Co-Kultur beobachteten wir tatsächlich eine signifikante Zellexpansion in allen interessierenden Proben, was auf produktive Antigen-spezifische Zellreaktionen hinweist. Interessanterweise war die fache Zunahme der Zellexpansion bei T-Zellen mit CAR, die vom PD-1-Promotor kontrolliert wurden, höher als bei der LV-Kontrolle (Abb. 1e). Um die Aufrechterhaltung des ursprünglich berichteten Verhaltens von CAR-T-Zellen mit manipulierter Rückkopplungsschleife weiter zu untersuchen und die zelluläre Auflösung der Tests zu verbessern, haben wir die Reaktion von LCL-expandierten Zellen unter polyklonaler und Antigen-spezifischer Restimulation bewertet (Abb. 1f). Insbesondere haben wir untersucht, ob die dynamische Hochregulierung der CD25- und CD69-Aktivierungsmarker mit der erwarteten Kinetik der CAR-Expression der manipulierten Rückkopplungsschleife übereinstimmt. Wie erwartet stiegen nach der polyklonalen Restimulation sowohl der CD25/CD69- als auch der CAR-Gehalt am Tag 2 nach der Restimulation signifikant an und kehrten am Tag 6 auf die Ausgangswerte zurück (Abb. 1f, blaue Linie). Bemerkenswert ist, dass nur in der Gruppe der aktivierungsinduzierbaren CAR-T-Zellen ein Anstieg der Aktivierungsmarker mit einem vorübergehenden Anstieg der CAR-Expression korrelierte. Dies stand im Gegensatz zur antigenspezifischen Restimulation, bei der eine verstärkte Aktivierung einem höheren CAR-Gehalt entsprach, was auf eine Expansion von CAR+-Zellen bei Zielangriff hinweist, unabhängig von der CAR-Integrationsstrategie, wobei die Aktivierungsmarker bis zum 6. Tag hochreguliert werden und später am 9. Tag nach der vollständigen Eliminierung der Zielzellen den Ausgangswert erreichen ( Abb. 1f, rote Linie). Bemerkenswert ist, dass die anfängliche Abnahme der CAR+-Frequenz nach antigenspezifischer Restimulation auf frühe Wechselwirkungen zwischen CAR+ und Zielzellen zurückzuführen ist, die zu sterischer Behinderung und CAR-Epitopmaskierung führen. Diese Daten bestätigten, dass die vorgeschlagene technische Rückkopplungsschleife mit der Zeit nicht nachlässt und zu einem dauerhaften Merkmal bearbeiteter Zellen wird. Bemerkenswert ist, dass wir während all unserer Studien einen erhöhten CAR-Ausgangswert (~ 40 %) (Abb. 1f) gegenüber dem Vorhandensein von PD-1 im Steady-State ((< 20 %) Abb. 1b) beobachteten. Dies kann das Ergebnis einer Bearbeitungsstrategie und eines Einflusses von PD-1 KO auf die allgemeine T-Zellbiologie oder ein Artefakt der In-vitro-Kultur sein.

Nachdem wir die aktivierungsinduzierbare CAR-Expression in praktischen Experimenten verifiziert hatten, beschlossen wir, die Funktionalität der generierten CAR-T-Zellen und die potenziellen Vorteile zusätzlicher Kontrollebenen zu testen. Zu diesem Zweck führten wir sowohl In-vitro- als auch In-vivo-Abtötungstests durch (Abb. 2a, b). Für den In-vitro-Abtötungstest haben wir künstlich hergestellte Rückkopplungsschleifen-CAR-T-Zellen vorbereitet, die entweder aktiviert (PD1 KO CAR KI +) oder nicht stimuliert (PD1 KO CAR KI -) waren, um ihre zytolytische Wirksamkeit zu messen (Abb. 2a). Wie erwartet steigerte die Stimulation die Abtötungsfunktion von CAR-T-Zellen, gemessen an einer schnelleren Clearance von CD19 + HEK-Zielzellen im Vergleich zur nicht stimulierten Kontrolle. Wichtig ist, dass dieses Ergebnis als verringerter Aktivierungszustand interpretiert werden kann, der sich in einer verringerten Wirksamkeit niederschlägt. Beide Beobachtungen stehen im Einklang mit dem Konzept, dass die Antigen-vermittelte Funktion durch den Zellaktivierungszustand reguliert werden kann. Anschließend bewerteten wir die Wirksamkeit der Zelltötung in einem Xenotransplantat-Raji-Mausmodell (Abb. 2b). Wie dargestellt, beseitigten die produzierten CAR-T-Zellen Tumorzellen innerhalb weniger Wochen auf vergleichbare Weise, unabhängig von der CAR-Integrationsstrategie. Bemerkenswert ist, dass auch T-Zellen, die CAR unter dem CD69-Promotor exprimierten, eine Tumorkontrolle zeigten, wenn auch weniger wirksam als unter PD-1 (ergänzende Abbildung 1c – e). Diese Daten zeigen nicht nur die Leistungsfähigkeit von PD1 KO CAR KI, sondern auch den allgemeinen Ansatz der CRISPR-vermittelten Gentechnik.

Eine aktivierte technische Rückkopplungsschleife: CAR-T-Zellen zeigen in vitro eine schnellere Abtötung im Vergleich zu ruhenden Zellen. Die Grafik zeigt die Impedanzmessung als Ergebnis der antigenspezifischen Abtötung von Zielzellen. Nicht transduzierte T-Zellen (negative Kontrolle), nur PD1-KO-T-Zellen (PD1 KO), LV-transduzierte CAR-T-Zellen (LV-Kontrolle) sowie ruhende (PD1 KO/CAR KI -) und polyklonal restimulierte (PD1 KO/CAR KI +). ) Es wurden CAR-T-Zellen mit technischer Rückkopplungsschleife verwendet. Das Experiment zeigt einzelne Datenpunkte, die aus dem Median von Vierfachen abgeleitet wurden. b Entwickelte CAR-T-Zellen mit Rückkopplungsschleife sind in einem In-vivo-Mausmodell genauso funktionsfähig wie hochmoderne CAR-T-Zellprodukte. Der Tumor wurde mithilfe von IVIS-Biolumineszenzmessungen nachgewiesen. Es werden Lumineszenzbilder eines repräsentativen Experiments gezeigt. Der Pfeil zeigt die erneute Belastung durch Mäuse an. c Entwickelte CAR-T-Zellen mit Rückkopplungsschleife können dabei helfen, das B-Zell-Kompartiment nach vollständiger Tumorausrottung wiederherzustellen. Der Gehalt an CAR-T-Zellen im Blut jeder einzelnen Maus wurde anhand der mittels Durchflusszytometrie gemessenen Zellfrequenzen berechnet. Die Zellen wurden vorab auf lebenden Lymphozyten isoliert. Im Kasten werden die Zellhäufigkeiten nach erneuter B-Zell-Exposition hervorgehoben (d35). Maus mit längerer Tumorlast, hervorgehoben durch einen Stern in b und c. Jede Zeile stellt die entsprechende Maus dar. Eine erneute Belastung mit B-Zellen am Tag 35 führt zu einem schnellen Anstieg des Gehalts an LV-transduzierten CAR-T-Zellen, während der Gehalt an CAR-T-Zellen mit künstlicher Rückkopplungsschleife unverändert bleibt. Delta wurde auf der Grundlage der CAR-T-Zellhäufigkeiten zwischen Tag 28 (Tumor-Clearance) und Tag 45 (nach erneuter Belastung) berechnet.

Basierend auf der In-vitro-Beobachtung, dass sich der Aktivierungszustand auf Populationsebene auf die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen auswirken kann, erwarteten wir, ähnliche Effekte in vivo zu rekapitulieren. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine erneute Belastung von Mäusen wenige Wochen nach der Tumorentfernung im Vergleich zu ständig CAR-exprimierenden Gegenstücken zu einer zumindest verzögerten Reaktion der aktivierungsinduzierten CAR-T-Zellen führen sollte (Abb. 2c, d). Zu diesem Zweck injizierten wir primäre B-Zellen, die vom gleichen Spender wie CAR-T-Zellen stammten, um ein Szenario nachzuahmen, bei dem gesunde B-Zellen nach einer CAR-vermittelten Tumorremission wieder in den Blutkreislauf des Patienten gelangen können. Obwohl wir B-Zellen aufgrund der Beschränkung unseres Mausmodells zu keinem Zeitpunkt direkt nachweisen konnten, beobachteten wir im Laufe der Zeit einen signifikanten Unterschied in den getesteten CAR-T-Zellpopulationen. Erstens beobachteten wir eine ziemlich konstante hohe Häufigkeit von CAR+-Zellen, die durch zufällige Integration erzeugt wurden, selbst 5 Wochen nach der ersten Injektion und 3–4 Wochen nach der Tumorentfernung (Abb. 2c). Im Gegensatz dazu nahm der Gehalt an CAR-T-Zellen im künstlichen Rückkopplungskreislauf nach zwei Wochen dramatisch ab, was der Abwesenheit eines Tumors entsprach. Nur bei einem Ausreißer waren sowohl die Aufrechterhaltung der CAR-T-Zellen als auch die Tumorpersistenz proportional verlängert (Abb. 2b, c). Interessanterweise beobachteten wir bei erneuter B-Zellen-Exposition (d35) einen signifikanten Anstieg konventioneller CAR-T-Zellen im Gegensatz zu aktivierungsinduzierbaren CAR-T-Zellen, was auf eine schnellere Antigen-spezifische Reaktion von Zellen mit konstitutiver CAR-Expression schließen lässt (Abb. 2d). Die beobachtete Reaktion ist höchstwahrscheinlich auf den viel höheren Gehalt an ehemaligen Zellen im Steady State zurückzuführen. Dieser Befund steht im Einklang mit unserer Hypothese, dass die kontinuierliche unveränderte Anwesenheit von CAR-T-Zellen im Kreislauf die natürliche Wiederherstellung von B-Zellen hemmt. Leider konnten unsere Studien nicht über 7 Wochen hinaus verlängert werden, da die Tiere GvHD-Symptome zeigten und aufgrund der Xenotransplantat-Natur des verwendeten Mausmodells getötet werden mussten.

Zusammenfassend haben wir durch In-vitro- und In-vivo-Proof-of-Concept-Experimente gezeigt, dass die CAR-Expression unter einem durch Aktivierung induzierbaren endogenen Promotor zu regulierten funktionellen CAR-T-Zellen führen kann.

In diesem Manuskript präsentieren wir einen Ansatz zur Kontrolle der exogenen Konstruktexpression und der damit gewonnenen Funktion bearbeiteter Zellen über endogene Genregulation in Form einer konstruierten Rückkopplungsschleife. Bei dieser Einstellung wird ein künstliches Gen, das für das Konstrukt von Interesse kodiert, an der Position in das Genom eingeführt, die von einem Promotor verwaltet wird, dessen Aktivität vom zellulären Aktivierungszustand abhängt. In den Proof-of-Concept-Experimenten konzentrierten wir uns auf ein klinisch relevantes Szenario und nutzten ein CAR-Konstrukt zur T-Zell-Modifikation. Wir verwendeten mehrere deutlich hochregulierte klassische aktivierungsabhängige T-Zellmarker, um unsere Hypothese zu testen, wie z. B. CD25, CD69, TIM3, TIGIT und PD-1. In diesem Fall kann das CAR-Konstrukt koexprimiert werden (z. B. CD69) oder das Zielgen zerstören (z. B. PD-1), wodurch theoretisch die Antitumorwirkung verbessert wird, je nachdem, was wünschenswerter ist. Ein weiterer technischer Ansatz für die physiologische Expression eines künstlichen Gens könnte die Integration nach Rezeptoren sein, die bei Erschöpfung herunterreguliert werden, wie etwa DNAM-1. Diese Strategie könnte die Erschöpfung terminaler T-Zellen verhindern und so die funktionelle T-Zellen-Persistenz erhöhen30,31. In den präsentierten Daten haben wir sowohl PD-1- als auch CD69-Gene ins Visier genommen und gestört. Allerdings haben wir die zuvor berichteten Vorteile einer PD-1-Störung nicht ausreichend bewertet.

In diesem aktivierungsinduzierbaren System konnten wir zeigen, dass der CAR-Gehalt auf Bevölkerungsebene durch den zellulären Aktivierungszustand reguliert werden kann. Darüber hinaus folgt diese Kontrolle dem physiologischen Expressionsmuster der Zielproteine und der Hochregulierungsdynamik bei indirekter (nicht CAR-vermittelter) Stimulation. Wir haben gezeigt, dass dieses Muster für mindestens drei Stimulationsrunden aufrechterhalten werden kann. Die einzige festgestellte Abweichung vom physiologischen Zustand war die viel höhere Häufigkeit CAR-positiver T-Zellen im unstimulierten Zustand. Diese höher als erwartete Basalexpression könnte durch die tonische Signalübertragung durch das CAR erklärt werden, obwohl ein nicht-clusterndes CAR gewählt wurde. Es wurde bereits früher beschrieben, dass die ligandenunabhängige CAR-Oligomerisierung T-Zellen in die Erschöpfung treiben könnte32. Alternativ können erhöhte Expressionsniveaus im Steady State als Artefakte einer In-vitro-Kultur und einer kulturinduzierten unspezifischen Aktivierung interpretiert werden. Interessanterweise ähnelten die CAR-positiven T-Zell-Häufigkeiten in In-vivo-Mausmodellen eher der natürlichen Expressionskinetik gezielter Aktivierungsmarker, da die CAR-Häufigkeit parallel zur Tumorausrottung und der erwarteten physiologischen Herunterregulierung von PD-1 abnahm.

Die Kontrolle über den CAR-Gehalt führte zu unterschiedlichen Qualitäten der Funktion von T-Zellpopulationen sowohl in vitro als auch in vivo. Im In-vitro-Abtötungstest eliminierten restimulierte Zellen Antigen-exprimierende Zellen wesentlich schneller als ruhende Zellen. Obwohl wir die Möglichkeit nicht formal ausschließen können, gehen wir nicht davon aus, dass dies auf eine durch Restimulation induzierte phänotypische Verschiebung aufgrund des kurzen Zeitrahmens zwischen den Erkrankungen zurückzuführen ist. Interessanterweise beobachteten wir im Raji-Mausmodell eine ausgeprägte Korrelation zwischen der T-Zellaktivität während der Tumorentfernung und dem Anteil der im Blut nachgewiesenen CAR-positiven T-Zellen. Diese Korrelation war sogar auf Einzeltierebene sichtbar, wo eine Maus mit längerer Persistenz bösartiger Zellen über einen längeren Zeitraum hohe CAR-T-Zellwerte aufwies. Bei allen Mäusen, die die PD1-KO-CAR-KI-Zellen erhielten, nahm die CAR-Häufigkeit jedoch nach der Tumoreliminierung erheblich ab, im Gegensatz zu Kontrolltieren, die CAR-T-Zellen erhielten, die durch lentivirale Transduktion erzeugt wurden. Infolgedessen reagierten lentivirale Kontrollmäuse auf die B-Zell-Injektion viel schneller, was durch einen deutlichen Anstieg des CAR-Gehalts gemessen wurde. Dennoch müssen wir feststellen, dass sich unsere Messungen auf die Häufigkeit von CAR-T-Zellen im Blut konzentrierten und wir eine Migration dieser Zellen in andere Körpernischen nicht ausschließen können.

Diese Ergebnisse deuten auf eine mögliche Anwendung der technischen Rückkopplungsschleife als zeitlichen Sicherheitsmechanismus für CAR-T-Zelltherapien hin. Wenn das Konstrukt-Knock-in mit einer gleichzeitigen Störung des endogenen TCR kombiniert wird, wird die T-Zell-Aktivierung (induziert durch die anfängliche Stimulation während der Herstellung) ausschließlich durch die CAR-Funktion aufrechterhalten und endet, wenn alle Zielzellen in vivo erschöpft sind. Mit anderen Worten: Solange CAR-T-Zellen ihre Zielzellen finden (z. B. CD19-exprimierende Tumorzellen), bleiben sie aktiv und erfüllen ihre Funktionen. Nach der Entfernung aller Zielzellen werden die T-Zell-Aktivierung und die biologisch assoziierte CAR-Expression abnehmen. Dies führt schließlich dazu, dass die CAR-T-Zellen nicht mehr reagieren, sodass sich gesunde Zellpopulationen, die dasselbe Zielantigen präsentieren, erholen können (z. B. gesunde B- oder T-Zellkompartimente). Darüber hinaus verhindert ein Mangel an endogenem TCR die Zellreaktivierung. Nicht reagierende doppelt negative CAR-TCR-T-Zellen sollten die Genesung des Patienten nicht beeinträchtigen und können aufgrund ihrer Unfähigkeit, tonische Signale zu empfangen, absterben. Um diese Hypothese vollständig zu bestätigen, müssen jedoch weitere Studien durchgeführt werden, beispielsweise Tests zur chronischen Restimulation.

Dies steht im Gegensatz zur klassischen LV-vermittelten Zufallsintegration, die die kontinuierliche Expression von CAR auf der T-Zelloberfläche vorantreibt. Solche CAR-T-Zellen reagieren höchstwahrscheinlich schneller auf einen möglichen Rückfall und können das Wiederauftreten des Tumors besser kontrollieren. Daher bestreiten wir nicht das Potenzial konventionell editierter CAR-T-Zellen, sondern bieten vielmehr einen neuen Editierungsmechanismus an, der je nach Zielindikation maßgeschneidert werden kann. Darüber hinaus haben wir unser Konzept nur an leicht verfügbaren CAR-Konstrukten (Anti-CD19) getestet. Es wäre immer noch interessant, unser CAR-Design unter anderen Umständen zu testen, beispielsweise bei Zielen mit geringerer Antigendichte (z. B. HER2 oder GPC2) und ob diese niedrige Antigendichte durch die Verwendung eines stärkeren endogenen Promotors und/oder von CAR mit hoher Affinität ausgeglichen werden muss Entwürfe.

Wir glauben, dass die vorgeschlagene Bearbeitungslogik auch in anderen klinisch relevanten Szenarien genutzt werden kann, in denen die gezielte Abtötung von Tumoren außerhalb des Tumors zeitlich begrenzte Zelltherapien wünschenswert macht. Die vorgestellte technische Rückkopplungsschleife ist ein leistungsstarkes Werkzeug, das modernste Methoden zur Genabgabe kombiniert, um T-Zelltherapien weiter zu verfeinern. Wir hoffen, dass unsere Arbeit weitere Entwicklungen auf dem Gebiet der CAR-T-Zellen anregen wird.

PBMCs wurden entweder aus frischen Buffy Coats mittels Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von Biocoll (Biochrom) isoliert oder aus einem Leukapheresematerial unter Verwendung der hauseigenen T-Zell-Selektionstechnologie ATC ausgewählt. Buffy Coats wurden von autologen erwachsenen weiblichen oder männlichen Blutspendern am Institut für Anästhesiologie des Deutschen Herzzentrums München (Freistaat Bayern und Technische Universität München) gewonnen. Von jedem Spender wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt und die Verwendung von Blutproben wurde gemäß nationalem Recht vom örtlichen Institutional Review Board und der Erklärung von Helsinki und Istanbul (Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Technischen Universität München: 360/13 und 55) genehmigt /14). Von gesunden Spendern erhaltene Leukaphereseproben wurden im CCC Cellex Collection Center Dresden unter dem ethischen Grundsatz (Ethikkommission der Technischen Universität Dresden: EK309072016) gesammelt.

Im Allgemeinen wurden T-Zellen mithilfe einer hauseigenen T-Zell-Selektionstechnologie angereichert33. Isolierte T-Zellen wurden in serumfreiem Medium (Thermo Fisher) in Gegenwart oder Abwesenheit von Zytokinen kultiviert. Angereicherte T-Zellen wurden zu einem bestimmten Zeitpunkt mit Expamers stimuliert, wie zuvor beschrieben30.

crRNA-Sequenzen für gRNAs waren 5-CGTCTGGGCGGTGCTACAACGTTT-TAGAGCTATGCT-3 für PDCD1 (auf PDCD1 ausgerichtet) und 5-AGAGTCTCTCAGCTGGTACAGTTTTAGAGCTATGCT-3 für TRAC. RNPs wurden gemäß den Empfehlungen des Herstellers hergestellt. Kurz gesagt, 80 µM tracrRNA (IDT-DNA) und 80 µM crRNA (IDT-DNA) wurden 5 Minuten lang bei 95 °C inkubiert und dann auf RT abgekühlt. 24 µM High-Fidelity-Cas9 (IDT-DNA) wurden langsam zur gRNA-Lösung gegeben, um RNPs mit 12 µM Cas9 und 20 µM gRNA sowie 20 µM Elektroporationsverstärker (IDT-DNA) zu ergeben. RNPs wurden 15 Minuten bei RT inkubiert und direkt zur Elektroporation verwendet.

Doppelsträngige DNA-PCR-Produkte wurden für Elektroporation und HDR (homologiegesteuerte Reparatur) verwendet. Plasmid-DNA wurde durch PCR gemäß dem folgenden Herstellerprotokoll amplifiziert. Der Temperaturzyklus wurde wie folgt durchgeführt: 95 °C und 30 s für die anfängliche Denaturierung, gefolgt von 34 Zyklen mit 95 °C für 30 s, 62 °C für 30 s, 72 °C für 3 min und 72 °C für 4 min als Abschluss Erweiterungsschritt. Die endgültigen PCR-Produkte wurden mit Ampure XP-Perlen gemäß dem Protokoll des Herstellers (Beckman Coulter) gereinigt. Alle HDR-Vorlagen wurden titriert. Im Allgemeinen ergab die Elektroporation von 1 µg DNA pro 1 × 106 Zellen die besten Knock-in-Effizienzen.

Gereinigte T-Zellen wurden 48 Stunden lang mit Expamers und 300 IE ml-1 rekombinantem menschlichem IL-2, 5 ng ml-1 rekombinantem menschlichem IL-7 (Peprotech) und 5 ng ml-1 IL-15 aktiviert. Der Expamer-Stimulus wurde durch Inkubation mit 1 mM D-Biotin (Sigma) unterbrochen. 1 × 106 Zellen wurden mit Cas9-Ribonukleoprotein und DNA-Matrizen in 20 μl Nucleofector Solution P3 (Lonza) mit einer 4D Nucleofector X-Einheit (Lonza) elektroporiert (Pulscode EH100). Nach der Elektroporation wurden die Zellen in serumfreiem Medium mit 180 IU ml−1 IL-2 bis zur ersten Analyse am Tag 5 nach der Bearbeitung kultiviert. Die KI-Effizienz wurde unter Verwendung eines Anti-CAR-Antikörpers gemessen, der spezifisch gegen das eingeführte scFv (Juno Therapeutics) ist. KO wurde durch Anfärben der Oberflächenexpression von PD1 (BioLegend) gemessen.

Genomische DNA wurde aus modifizierten Zellen, die den transgenen und integrierten Rezeptor exprimierten, extrahiert (PureLink Genomic DNA Mini Kit, Invitrogen). PCRs wurden vom 5'-Homologiearm bis zum 3'-Homologiearm durchgeführt, um die vollständige Konstruktintegration zu überprüfen. Die PCR-Amplifikation der DNA-Sequenz von außerhalb der 5'-Genom-DNA in die integrierte DNA-Sequenz validierte die Insertion in die gewünschten Loci. Gereinigte PCR-Produkte wurden anschließend Sanger-sequenziert (Eurofins).

Für die In-vitro-Expansion wurden editierte T-Zellen mit EBV-transformierten B-Zellen (LCL) im Verhältnis 1:7 (E:T) inkubiert und das beschriebene Protokoll entsprechend durchgeführt33,34. Die CAR-Häufigkeit und die absoluten Zahlen wurden über die angegebenen Expansionszeitpunkte überwacht und gemessen.

Das sequentielle Stimulationsexperiment wurde mit expandierten und ruhenden manipulierten CAR-T-Zellen durchgeführt. Die Expamers-Stimulation erfolgte wie zuvor beschrieben. Das Stimulationssignal wurde durch Zugabe von 1 mM Biotin unterbrochen. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und in frisches Medium mit niedrig dosiertem IL-2 (25 IU ml−1) überführt. Die Oberflächenexpression von Aktivierungsmarkern wurde durch Durchflusszytometrie überwacht (siehe unten) und die Zellzahl wurde gemessen (Nucleocounter, Chemotec).

Für den In-vitro-Abtötungstest wurde das xCELLigence RTCA System (ACEA Biosciences Inc.) verwendet. Die spezifische Lyse wurde anhand von CD19-exprimierenden humanen embryonalen Nierenzellen (HEK293-CD19+) gemessen. 2 × 104 Zielzellen wurden in eine E-Platte mit 96 Vertiefungen (ACEA Biosciences Inc.) ausgesät und über Nacht ruhen gelassen. Gentechnisch veränderte CAR-T-Zellen wurden im Verhältnis 5:1 (E:T) hinzugefügt und für die angegebene Zeit inkubiert. Änderungen im Impedanzsignal wurden in Echtzeit gemessen und mit RTCA Software Pro (ACEA Biosciences Inc.) analysiert. Alle verwendeten Zelllinien waren unverändert und wurden von ATCC erworben.

Die Durchflusszytometrie wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt33. Die folgenden Antikörper wurden von BioLegend gekauft und für die Analyse verwendet. CD3 (Klon OKT3-PC7), CD4 (Klon OKT4-BV421), CD8 (Klon RPA-T8-BV510), CD45 (Klon HI30), PD1 (Klon EH12.2H7-FITC und -BV421), CD69 (Klon FN50- APC/Fire), CD19 (Klon HIB19-BV421 und -FITC) und CD25 (Klon BC96-BV605). Darüber hinaus wurde ein selbst hergestellter Anti-Idiotyp-Antikörper (CD19) verwendet, der an APC (Bristol Myers Squibb) und Propidiumiodid (Thermo Fisher Scientific) gekoppelt war. Alle Antikörperverdünnungen wurden gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt.

NSG-SGM3-Mäuse (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtmWjlTg (CMV-IL3, CSF2, KITLG) 1Eav/MloySzJ, NSGS, The Jackson Laboratory) wurden vom Jackson Laboratory (The Jackson Laboratory) gekauft und in einer pathogenfreien Einrichtung vor Ort gezüchtet an der Technischen Universität München nach Standardverfahren. Für die Experimente wurden 6–10 Wochen alte Mäuse (männlich und weiblich) verwendet. Alle Experimente wurden wie zuvor beschrieben und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Regierung von Oberbayern durchgeführt. Alle Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Regierung von Oberbayern genehmigt (ROB-55.2-2532.Vet_02-17-138 und Vet_02-18-162).

Die B-Zell-Rechallenge wurde durch Injektion von 10 × 106 mit dem Spender übereinstimmenden B-Zellen 2 Wochen nach der Tumorentfernung durchgeführt. Tierversuche wurden unter Einhaltung aller relevanten ethischen Vorschriften für Tierversuche durchgeführt.

Durchflusszytometrische Daten wurden mit der FlowJo-Software (FlowJo, LLC) analysiert. Grafiken und statistische Analysen wurden mit der GraphPad Prism-Software (GraphPad Software) erstellt.

Für alle Experimente wurde die Stichprobengröße auf der Grundlage standardmäßiger experimenteller Vorgehensweisen ausgewählt (meistens 3 oder mehr unabhängige Experimente), es sei denn, die Anzahl der Wiederholungen war technisch anspruchsvoll, z. B. bei Mausstudien. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des (ungepaarten) Student-T-Tests analysiert. Es wurden keine statistischen Berechnungen der Stichprobengröße durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Autoren erklären, dass die für diese Studie generierten oder analysierten Daten in der Arbeit und den Zusatzinformationen verfügbar sind. Die Quelldaten hinter den Grafiken sind in den Zusatzdaten 1 verfügbar. Die beschriebenen Ergebnisse sind Eigentum der Bristol-Myers Squibb Company und einige Informationen gelten als Geschäftsgeheimnis. Die Rohdaten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind bei den Autoren erhältlich, es können jedoch Einschränkungen hinsichtlich der Verfügbarkeit dieser Daten gelten. Daten sind jedoch auf begründete Anfrage und mit Genehmigung der Bristol-Myers Squibb Company bei den Autoren erhältlich.

Kochenderfer, JN et al. Ausrottung von Zellen der B-Linie und Rückbildung von Lymphomen bei einem Patienten, der mit autologen T-Zellen behandelt wurde, die gentechnisch verändert wurden, um CD19 zu erkennen. Blut 116, 4099–4102 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Adami, A. & Mahe, J. Ein Überblick über die Aktivitäten klinischer CAR-T-Zell-Studien bis 2021. Immunother. Adv. 1, ltab004 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

MacKay, M. et al. Die therapeutische Landschaft für Zellen, die mit chimären Antigenrezeptoren hergestellt wurden. Nat. Biotechnologie. 38, 233–244 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fraietta, JA et al. Eine Störung von TET2 fördert die therapeutische Wirksamkeit von auf CD19 gerichteten T-Zellen. Natur 558, 307–312 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ruella, M. et al. Induktion einer Resistenz gegen die Therapie mit chimären Antigenrezeptor-T-Zellen durch Transduktion einer einzelnen leukämischen B-Zelle. Nat. Med. 24, 1499–1503 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bishop, DC et al. Entwicklung eines CAR-T-Zell-Lymphoms bei 2 von 10 Patienten, die effektiv mit piggyBac-modifizierten CD19-CAR-T-Zellen behandelt wurden. Blut 138, 1504–1509 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jinek, M. et al. Eine programmierbare dual-RNA-gesteuerte DNA-Endonuklease für die adaptive bakterielle Immunität. Wissenschaft 337, 816–821 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schober, K. et al. Orthotopischer Ersatz der α- und β-Ketten des T-Zell-Rezeptors unter Erhalt der nahezu physiologischen T-Zell-Funktion. Nat. Biomed. Ing. 3, 974–984 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Frigault, MJ Identifizierung chimärer Antigenrezeptoren, die die konstitutive oder induzierbare Proliferation von T-Zellen vermitteln. Krebsimmunol. Res. 3, 356–367 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Roth, TL et al. Neuprogrammierung der Funktion und Spezifität menschlicher T-Zellen durch nicht-virales Genom-Targeting. Natur 559, 405–409 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haberle, V. & Stark, A. Eukaryotische Kernpromotoren und die funktionellen Grundlagen der Transkriptionsinitiierung. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 19, 621–637 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eyquem, J. Die Ausrichtung eines CAR auf den TRAC-Locus mit CRISPR/Cas9 verstärkt die Tumorabstoßung. Natur 543, 113–117 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Maude, SL et al. Tisagenlecleucel bei Kindern und jungen Erwachsenen mit lymphoblastischer B-Zell-Leukämie. N. engl. J. Med. 378, 439–448 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Killock, D. Anti-CD22-CAR-T-Zellen in ALL. Nat. Rev. Clin. Oncol. 17, 391 (2020).

PubMed Google Scholar

Munshi, NC et al. Idecabtagene Vicleucel bei rezidiviertem und refraktärem multiplem Myelom. N. engl. J. Med. 384, 705–716 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kalos, M. et al. T-Zellen mit chimären Antigenrezeptoren haben starke Antitumorwirkungen und können bei Patienten mit fortgeschrittener Leukämie ein Gedächtnis aufbauen. Wissenschaft. Übers. Med. 3, 95ra73 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Paszkiewicz, PJ et al. Die gezielte antikörpervermittelte Depletion muriner CD19-CAR-T-Zellen kehrt die B-Zell-Aplasie dauerhaft um. J. Clin. Investieren. 1, 4262–4272 (2016).

Artikel Google Scholar

Juillerat, A. et al. Einfache Erzeugung hochreiner, handelsüblicher allogener CAR-T-Zellen. Front Bioeng. Biotechnologie. 8, 678 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Rurik, JG et al. In vivo produzierte CAR-T-Zellen zur Behandlung von Herzverletzungen. Wissenschaft 375, 91–96 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Roybal, KT et al. Präzise Tumorerkennung durch T-Zellen mit kombinatorischen Antigen-Erkennungsschaltkreisen. Zelle 164, 770–779 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Srivastava, S. et al. Die logikgesteuerte Expression des chimären ROR1-Antigenrezeptors verhindert die T-Zell-vermittelte Toxizität für normales Gewebe und ermöglicht ein selektives Tumor-Targeting. Krebszelle 35, 489–503 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Han, X., Wang, Y., Wei, J. & Han, W. Auf mehrere Antigene ausgerichtete chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen für die Krebstherapie. J. Hämatol. Oncol. 12, 128 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kloss, CC, Condomines, M., Cartellieri, M., Bachmann, M. & Sadelain, M. Die kombinatorische Antigenerkennung mit ausgewogener Signalübertragung fördert die selektive Tumorausrottung durch manipulierte T-Zellen. Nat. Biotechnologie. 31, 71–75 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ode, Z., Condori, J., Peterson, N., Zhou, S. & Krenciute, G. CRISPR-vermittelte nicht-virale ortsspezifische Genintegration und -expression in T-Zellen: Protokoll und Anwendung für die T-Zelltherapie. Krebserkrankungen (Basel) 12, 1704 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Conley, JM, Gallagher, MP & Berg, LJ T-Zellen und Genregulation: Das Einschalten und Auftauchen von Genen nach T-Zell-Rezeptor-Stimulation in CD8-T-Zellen. Vorderseite. Immunol. 7, 76 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Gros, A. et al. PD-1 identifiziert das patientenspezifische CD8+-tumorreaktive Repertoire, das menschliche Tumore filtert. J. Clin. Investieren. 124, 2246–2259 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McGowan, E. PD-1 störte CAR-T-Zellen bei der Behandlung solider Tumoren: Versprechen und Herausforderungen. Biomed. Pharmakotherapeut. 121, 109625 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, Z. et al. Phase-I-Studie zu CAR-T-Zellen mit PD-1- und TCR-Störung in Mesothelin-positiven soliden Tumoren. Zellmol. Immunol. 18, 2188–2198 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Doetsch, S. et al. Langfristige Persistenz und Funktionalität adoptiv übertragener antigenspezifischer T-Zellen mit genetisch entfernter PD-1-Expression. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 120, e2200626120 (2023).

Artikel CAS Google Scholar

Poltorak, MP et al. Expamers: eine neue Technologie zur Kontrolle der T-Zell-Aktivierung. Wissenschaft. Rep. 10, 17832 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cella, M. et al. Der Verlust von DNAM-1 trägt zur Erschöpfung der CD8+-T-Zellen bei chronischer HIV-1-Infektion bei. EUR. J. Immunol. 40, 949–954 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Long, AH et al. Die 4-1BB-Kostimulation verbessert die Erschöpfung der T-Zellen, die durch tonische Signale chimärer Antigenrezeptoren hervorgerufen wird. Nat. Med. 21, 581–590 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Radisch, S. et al. Automatisierte spurlose Zellchromatographieplattform der nächsten Generation für die GMP-konforme Zellisolierung und -aktivierung. Wissenschaft. Rep. 12, 6572 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Turtle, CJ et al. CD19-CAR-T-Zellen mit definierter CD4+:CD8+-Zusammensetzung bei erwachsenen B-Zell-ALL-Patienten. J. Clin. Investieren. 126, 2123–2138 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

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Wir danken Michaela Wagner, Eileen Benke und Dr. Katrin Manske für ihre hervorragende technische Unterstützung.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Simon P. Fraessle, Claudia Tschulik und Manuel Effenberger.

Juno Therapeutics GmbH, ein Unternehmen von Bristol-Myers Squibb, Grillparzerstr. 10, 81675, München, Deutschland

Simon P. Fraessle, Claudia Tschulik, Manuel Effenberger, Vlad Cletiu, Maria Gerget, Lothar Germeroth, Christian Stemberger & Mateusz P. Poltorak

Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, Technische Universität München, München, Deutschland

Kilian Schober & Dirk H. Busch

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SPF, CT, ME, VC und MG trugen zum Studiendesign bei, führten Experimente durch und analysierten die Daten. KS und DHB entwickelten und stellten gentechnische Protokolle bereit. CS, LG und MPP haben das Projekt entworfen und geleitet. SPF, ME und MPP haben das Manuskript zusammengestellt. Alle Autoren haben dieses Manuskript rezensiert.

Korrespondenz mit Manuel Effenberger.

SPF, CT, ME, VC, MG, DHB, CS, LG und MPP sind derzeit bei Juno Therapeutics GmbH, einem Unternehmen von Bristol-Myers Squibb, beschäftigt und besitzen Aktien von Bristol-Myers Squibb. LG, CS und MPP sind in bereits eingereichten entsprechenden Patentanmeldungen als Erfinder aufgeführt. Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Mo Li und Christina Karlsson Rosenthal. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Fraessle, SP, Tschulik, C., Effenberger, M. et al. Die durch Aktivierung induzierbare CAR-Expression ermöglicht eine präzise Kontrolle über die Funktion manipulierter CAR-T-Zellen. Commun Biol 6, 604 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04978-w

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Eingegangen: 15. November 2022

Angenommen: 25. Mai 2023

Veröffentlicht: 05. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04978-w

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